Putra Pratama's page

Uji Mutagenesitas

Uji mutagenesitas adalah uji yang digunakan untuk mengetahui apakah suatu bahan bersifat karsinogenik, yaitu dapat menimbulkan sel kanker. Zat yang bersifat karsinogenik ini dapat dibagi dalam beberapa, yaitu hidrokarbon aromatik, polisiklik, amin aromatik, senyawa pengalkil, dan senyawa yang berasal dari alam. Sifat karsinogen senyawa kimia secara tidak langsung dapat ditentukan dengan cara uji mutagenisitas.
Beberapa metode dapat digunakan untuk menentukan sifat karsinogenik suatu senyawa kimia. Pengujian dapat dilakukan dengan cara menggunakan hewan percobaan, serangga, sel mamalia, atau dengan bakteri. Pengujian yang paling sering digunakan adalah uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri. Pengujian ini memerlukan waktu relatif singkat dan biaya yang lebih murah jika dibandingkan dengan cara-cara uji mutagenesitas lainnya.
Uji mutagenesitas dengan menggunakan bakteri dikenal sebagai uji Ames yang menggunakan bakteri. Salmonellla thypimurium TA 97, TA 98, TA 100, dan TA 102. setiap galur mengandung gen mutasi histidin, mutasi rfa, mutasi uvrB, dan faktor R untuk meningkatkan kepekaan bakteri terhadap senyawa mutagenik. Selain itu, digunakan juga galur Eschericia coli WP2 yang mengandung gen mutasi uvrA.
Bakteri yang diggunakan adalah bakteri yang telah dimutasi terlebih dahulu sehingga tidak mampu menyintesis salah satu jenis asam amino esensial, misalnya histidin atau triptofan, untuk pertumbuhannya. Oleh karena itu, bakteri membutuhkan media yang mengandung histidin atau triptofan agar dapat tumbuh normal. Jika bahan uji yang diperiksa bersifat mutagenik, bakteri uji akan mengalami mutasi balik ke fungsinya yang semula. Dengan demikian, gen his dan gen trp yang termutasi akan mengalami mutasi balik sehingga dengan gen his dan gen trp tersebut kembali normal dan bakteri uji dapat menyintesis sendiri histidin dan triptofan yang dibutuhkan dalam pertumbuhan bakteri, yang ditunjukkan dengan pertumbuhan bakteri di dalam media yang kekurangan histidin atau triptofan.
Setiap galur bakteri mengandung tipe mutasi berbeda terhadap gen histidin. Galur bakteri uji yang mengandung mutasi gen lain yang diperlukan untuk menaikkan kepekaan bakteri dalam mendeteksi mutagen. Mutasi rfa menyebabkan hilangnya sebagian sawar lipopolisakarida yang membungkus permukaan bakteri sehingga mengakibatkan naiknya permeabilitas terhadap molekul besar seperti benzo[a]piren yang tidak dapat berpenetrasi ke dalam sel normal.
Mutasi lain, uvrB, adalah penghilangan gen pengode sistem excision repair DNA dan mutasi gen bio sehingga bakteri membutuhkan biotin untuk pertumbuhannnya.
Galur TA 102 tidak mengandung mutasi uvrB karena dibuat untuk mendeteksi mutagen yang membutuhkan sistem excision repair utuh. Galur bakteri uji standar TA 97, TA 98, TA 100, dan TA 102 mengandung plasmid faktor R, pKM 101. TA 102 juga mengandung multicopy plasmid, pAQ1, yang mengandung mutasi hisG428 dan gen resisten tetrasiklin.
Galur TA 100 mempunyai mutasi hisG46 , yaitu pada gen hisG yang mengodekan enzim pertama untuk biosintesis histidin. Mutasi ini dipastikan dengan analisis urutan DNA (DNA sequence), yaitu terjadinya substitusi leusin (-CTC-) menjadi prolin(-CCC-) dalam bakteri. TA 100 mendeteksi mutagen yang menyebabkan substitusi pasangan basa yang mula-mula terjadi pada salah satu pasangan G-C.
Mutasi hisD3052 pada TA 98 adalah gen hisD pengode histidinol dehidrogenase. Galur ini dapat mendeteksi beberapa mutagen frameshift. Mutagen dapat memantapkan pasangan tergeser yang sering terjadi pada pengulangan urutan DNA atau hot spot DNA yang menghasilkan mutasi frameshift yang memulihkan pembacaan frame yang benar untuk sintesis histidin. Mutais hisD3052 mempunyai urutan pengulangan –GC- ayng terdapat di dekat tempat mutasi frameshift a-1 pada gen hisD.
Galur frameshif baru, TA 97, mempunyai penambahan sitosin yang menghasilkan 6 sitosin pada tempat mutasi hisD6610, dan juga mempunyai hot spot kedua dari paangan GC berseling dekat sitosin.
Galur TA 102 memiliki gen mutasi histidin yang berlokasi pada multicopy plasmid pAQ1. gakur ini terutama sensitif terhadap mutagen oksidatif dan senyawa penaut silang (cross-linking agent).
Galur bakteri Escerichia coli WP2 mempunyai gen mutasi untuk biosintesis triptofan. Mutasi yang dimiliki bakteri ini dapat dreversi kembali oleh mutagen yang menyebabkan substitusi pasangan basa. Akan tetapi, bakteri ini tidak mempunyai mutasi rfa sehingga tidak mampu mendeteksi mutagen yang memiliki ukuran molekul besar.
Bakteri uji yang akan digunakan untuk uji Ames harus mempunyai sifat genotip yang telah disyaratkan. Konfirmasi sifat genotip ini harus dilakukan:
•segera setelah menerima biakan,
•pada waktu pembuatan liofisilat,
•pada saat revertan spontan per cawan terletak di luar rentang normal, dan
•jika bakteri-bakteri tersebut kehilangan sensitivitas terhadap mutagen.
Konfirmasi genotip yang dilakukan adalah uji butuh histidin untuk Salmonella thypimurium, uji butuh triptofan untuk Escerichia coli, mutasi rfa dan mutasi uvrB untuk Salmonella thypimurium, dan mutasi uvrA utuk Escerichia coli, uji faktor R, uji plasmid pAQ1 untuk galur Salmonella thypimurium TA 102, dan uji reversi spontan
Selain konfirmasi genotip, perlu juga dilakukan uji mutagen standar. Walaupun hasil konfirmasi sifat genotip tidak memenuhi syarat, tetapi jika mutagen standar tidak memberikan hasil positif, bakteri tersebut tidak dapat digunakan untuk pengujian. Mutagen standar yang sering digunakan adalah 4-nitrokuinolin-N-oksida (NQNO), 4-fluoro-3-nitrofenil azida (FNPA), 2-nitrofluoren (2NF), dan metil metan sulfonat (MMS), uji mutagen standar ini dapat memastikan kepekaan galur bakteri uji untuk mengalami mutasi balik jika berkontak dengan zat karsinogen.
Untuk zat karsinogen yang tidak aktif sebelum bioaktivasi, pengujian memerlukan sistem bioaktivasi yang terdiri dari fraksi mikrosoma hati tikus atau hewan lain. Aktivitas enzim mikrosoma biasanya meningkat jika hewan diinduksi dengan zat penginduksi seperti fenobarbital. Selain itu, diperlukan penambahan kofaktor pada enzim sebelum diinkubasi.









Prosedur pelaksanaan uji mutagenesis
Uji pendahuluan


Dilakukan untuk menetapkan dosis terbaik dan kelompok dosis uji lainnya. Pada uji ini digunakan 6 kelompok dosis uji,yaitu misalnya 10.000, 5.000, 2.500, 1.000, 500 dan 250μg zat uji tiap lempeng. Berdasarkan hasil uji pendahuluan dilakukan pemilihan dosis uji untuk pengujian selanjutnya.

Uji mutagenesis



Penafsiran hasil
Zat uji dinyatakan mutagen dengan metode ini jika terdapat perbedaan yang berarti antara jumlah koloni revertan pada lempeng uji dengan jumlah koloni revertan pada lempeng kontrol negatif, dengan ketentuan untuk galur uji Salmonella typhimurium TA 98 dan TA 100, ada hubungan dosis-respon pada minimal 3 dosis uji dan jumlah koloni revertan pada dosis tertinggi harus minimal 2 kali jumlah koloni revertan pada lempeng kontrol. Pada galur TA 100, kadang-kadang perbandingan kedua nilai tersebut tidak kelipatan 2, tapi pola hubungan dosis tanggapan pada beberapa dosis harus jelas.




Uji mutasi rfa
Prinsip:
Kristal violet akan menginhibisi pertubuhan bakteri dengan mutasi rfa pada lempeng agar nutrisi setelah diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam

Prosedur:
Untuk setiap galur bakteri uji disiapkan 2 tabung reaksi steril dan 2 lempeng agar nutrisi. Kedalam tabung reaksi steril dimasukkan o,1 ml biakan semalam bakteri uji yang sesuai dan ditambahkan 2,0 ml “top agar” cair (suhu ± 45°C), dihomogenkan lalu segera dituangkan pada permukaan lempeng agar nutrisi dan didistribusikan sampai merata kemudian diamkan hingga pada atau membeku. Setelah padat atau beku pada bagia atasnya diletakkan cakram kertas steril diameter 8 mm dan tetesan 0,01 ml larutan kristal violet 1 mg/ml. Kemudian semua lempeng diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Amati ada tidaknya daerah hambatan disekitar cakram kertas. Adanya hambatan menunjukkan bahwa ada galur bakteri tersbut terdapat mutasi rfa.

Persyaratan:
Mutasi rfa terdapat pada Salmonella typhimurium TA 97, TA 98, TA 102, dan E. Coli WP2 uvrA.






Uji konfirmasi
Uji konfirmasi genetik digunakan untuk mengetahui sifat genotip bakteri uji yang harus digunakan pada uji mutagenesis. Bakteri uji yang digunakan untuk uji Ames harus mempunyai sifat genotip yang telah disyaratkan. Konfirmasi sifat genotip ini harus dilakukan :
-Segera setelah menerima biakan
-Waktu pembuatan liofilisat
-Pada saat revertan spontan percawan terletak diluar rentang normal
-Bila bakteri-bakteri tersebut kehilangan sensitifitas terhadap mutagen
Konfirmasi genotip yang dilakukan adalah uji butuh histidin untuk Salmonella typhimurium dan uji butuh triptofan untuk Escherichia coli, mutasi rfa dan mutasi uvrB untuk Salmonella typhimurium dan uvrA untuk Escherichia coli, faktor R dan uji plasmid pAQ1 untuk galur Salmonella typhimurium TA 102, serta uji reverse spontan.

•Uji butuh (untuk Salmonella typhimurium) dan triptofan (E.coli)
Prinsip: Bakteri yang memerlukan histidin (Salmonella typhimurium) akan tumbuh pada medium yang mengandung histidin (Salmonella typhimurium) atau triptofan (E.coli) dan tidak akan tumbuh pada media yang tidak mengandung histidin (Salmonella typhimurium) atau triptofan (E.coli) setelah diinkubasi pada suhu 37˚C selama 18-24 jam.

Prosedur:
Untuk setiap galur bakteri uji disiapkan masing-masing satu lempeng glukosa minimal, lempeng triptofan dan lempeng histidin-biotin. Setiap lempeng ditandai dengan membuat tiga garis sejajar pada dasar lempeng dan setiap garis ditandai dengan galur tertentu. Biakan semalam bakteri uji digoreskan satu sengkelit berturut-turut pada permukaan lempeng glukosa minimal, lempeng triptofan dan lempeng ahistidin-biotin dengan mengikuti garis sejajar pada dasar lempeng dan keringkan di dalam lemari bersih selama 10-15 menit. Kemudian lempeng-lempeng tersebut diinkubasi pada posisi terbalik pada 37˚C selama 18-24 jam. Setelah masa inkubasi, amati ada tidaknya pertumbuhan bakteri.
Persyaratan: bakteri Salmonella typhimurium TA 97, TA 98, TA 100, TA 102 akan tumbuh hanya pada lempeng yang mengandung histidin dan Escherichia coli WP2 uvrA hanya tumbuh pada lempeng yang mengandung triptofan.
Uji Mutagenesis